β-半乳糖苷酶基因的克隆与分析.doc

摘要：β-半乳糖苷酶简称乳糖酶，细菌、放线菌、植物、真菌、以及动物肠道中广泛存在。该酶能将一分子乳糖水解为一分子半乳糖和一分子葡萄糖，并能转移半乳糖苷，主要应用于治疗不耐受乳糖的情况，也可以加工牛乳、乳清，生产低乳糖乳制品。本论文的初衷是从环境中分离出能分泌乳糖酶的菌株，克隆并获得乳糖酶基因，为工业化生产提供材料。

以乳糖为惟一碳源，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为显色剂，从土壤中筛选出最高的产β-半乳糖苷酶且生长较好的菌株。

根据 GenBank 已报道的β-半乳糖苷酶基因的 DNA序列，利用 PCR 引物设计，设计引物，扩增目的基因组，并将其克隆进大肠杆菌表达质粒载体pGEM-T 中构建重组质粒pGEM-T-lacZ，借助 X-gal 显色在大肠杆菌 DH5a中筛选阳性克隆子。得到β-半乳糖苷酶基因，测得该β-半乳糖苷酶基因全长1881bp，编码627个氨基酸，无信号肽序列。

克隆表达β-半乳糖苷酶，既能够降解其中的乳糖，克服乳糖不耐症的问题而且不存在食品安全问题，并能为后期工业生产应用打下坚实基础。

关键词：β-半乳糖苷酶；基因克隆；PCR

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 β-半乳糖苷酶的当前应用现状-1

1.1.1 β-半乳糖苷酶的自然来源-1

1.1.2 β-半乳糖苷酶的生理功能-1

1.2 β-半乳糖苷酶的应用领域与应用前景-2

1.2.1 β-半乳糖苷酶应用于食品方面-2

1.2.2 β-半乳糖苷酶应用于免疫和检测方面-3

1.2.3 β-半乳糖苷酶基因应用于基因工程方面-3

1.2.4 β-半乳糖苷酶基因应用于基因诊断、治疗方面-4

1.3 β-半乳糖苷酶的研究意义-4

1.3.1 选题背景-4

1.3.2 研究意义-5

2 材料与方法-6

2.1 试剂与仪器-6

2.1.1 主要试剂-6

2.1.2 主要仪器-8

2.2常用溶液的配制-9

2.2.1菌种培养基-9

2.2.2 DNA提取所用溶液-9

2.2.3基因的扩增及克隆所用试剂-9

2.3 方法-11

2.3.1 菌种筛选-11

2.3.2 菌种鉴定-11

2.3.3 β-半乳糖苷酶基因的克隆-13

3  结果与讨论-18

3.1菌株筛选结果：-18

3.1.1实验菌株吸光度值测得数据：-18

3.1.2菌株筛选图片-18

3.2目标乳酸菌基因组DNA的提取-19

3.3引物的设计-19

3.4 菌株β-半乳糖苷酶基因的扩增-20

3.5 β-半乳糖苷酶基因PCR扩增产物的回收-20

3.5.1扩增片段的滞后质粒检测-21

3.5.2 基因片段滞后质粒的酶切鉴定-21

3.5.3滞后质粒的PCR扩增检测-22

3.5.4 对经过检测的阳性克隆作永久性保存-22

结论-25

致谢-26

参考文献-27